1、實(shí)�(yàn)?zāi)�?/p>
(1)了解HPLC在中藥分析方面的�(yīng)用�
(2)熟悉梯度洗脫的設(shè)�(jì)和操作�
2、實(shí)�(yàn)原理
中藥(植物�)中,含有多種有機(jī)和無�(jī)化合物,如生物堿、黃酮、皂苷、多聚糖等。每一味中藥都有它�(dú)特的一種或幾種主要有效成分。弄清中藥的有效成分是中藥分子藥理學(xué)的關(guān)鍵,川芎中的有效成分之一是藁木內(nèi)酯。中藥的傳統(tǒng)炮制法是水煎,因此很多水溶�(極�)物質(zhì)被提取出來,由于這些水溶性有�(jī)分子的協(xié)同作用,也會有很多脂溶�(非極�)物質(zhì)被提取出來。本�(shí)�(yàn)采用反相HPLC體系來分離川芎提取液。在反相HPLC中,極性物�(zhì)先流出,非極性物�(zhì)后流出。要能在盡可能短的時(shí)間內(nèi)�(dá)到較好的分離,選擇適�(dāng)極性的流動相是�(guān)鍵。對于較簡單的樣品可以采用均一的混合溶劑作為洗脫液(稱等�(qiáng)度洗�),但對于�(fù)雜的混合物,如中藥提取物,必須采用梯度洗脫的方法,既流動相的極性隨�(shí)間在變化,洗脫能力不斷增加,使各組分既能得到彼此的分離,又能使色譜峰分布均勻�
川芎中有�(jī)物在210�300nm范圍�(nèi)有較�(qiáng)的吸收。因此可采用紫外檢測器�(jìn)行檢測。采用外�(biāo)�(一�(diǎn)工作曲線�)對川芎的主要成分藁本�(nèi)酯�(jìn)行定量�
3、儀器與試劑
儀器:高效液相色譜儀,紫外檢測器,梯度淋洗裝置,溶劑脫氣裝置�
試劑:甲�(色譜�),水(重蒸去離子水),川芎浸膏,藁本�(nèi)酯標(biāo)�(zhǔn)樣品�
4、實(shí)�(yàn)�(nèi)容與步驟
(1)參照儀器使用說明,使儀器處于工作狀�(tài)�
(2)�(shè)置色譜參�(shù):色譜柱為C18柱;流動相A為甲醇,B為水;流速為1.0mL/min,柱�30℃;檢測波長270nm�
(3)配置藁本�(nèi)酯標(biāo)�(zhǔn)樣品溶液:準(zhǔn)確稱量藁本內(nèi)酯標(biāo)樣,以甲醇為溶劑配置,濃度約�1000mg/L�
配置被測樣品:稱取川芎浸�250mg,用甲醇溶解定容�50mL�
(4)先以50 %的甲醇/水溶劑等�(qiáng)度洗脫,用六通閥注入被測樣品,觀察分離情況�
(5)再以80%的甲醇/水溶劑等強(qiáng)度洗脫,重復(fù)(4)的操作�
(6)�(shè)置梯度程序:開始�90%的B�60min�(nèi)線性地改變?yōu)?00%A,用六通閥注入被測樣品,觀察分離情況�
(7)檢測波長分別�(shè)�260nm�280nm,注入被測樣品�
(8)選擇適宜的色譜條�(流動相,檢測波長)注入藁本�(nèi)酯標(biāo)樣,記錄保留�(shí)間和峰面�(用以定性和�(jì)算校正因�),重�(fù)3次,取平均�(面積誤差小于3�)�
(9)注入被測川芎提取液樣品,重復(fù)3次,取平均�(面積誤差�3%之�(nèi))�
(10)按關(guān)�(jī)程序�(guān)�(jī)�
5、注意事�(xiàng)
(1)如果�(shí)�(yàn)直接用市售川芎飲片作樣品�(shí),可以稱取適量飲片,用水提取1h(保持微沸),水提物用微孔膜過濾后直接�(jìn)樣,或用氯仿等溶劑萃取后�(jìn)樣�
(2)中藥提取物中成分�(fù)雜,所含糖類、蛋白類等物�(zhì)有可能使色譜柱性能下降,必要時(shí)將川芎浸膏用溫水溶解后,用氯仿或乙酸乙酯萃取,有�(jī)相作為樣品即可�
6、數(shù)�(jù)處理
(1)整理出不同條件下的色譜峰的保留時(shí)間、峰面積,計(jì)算藁本內(nèi)酯的分離度�
(2)用外�(biāo)法計(jì)算川芎浸膏中的藁本內(nèi)酯的含量�
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