1、實驗目的
(1)了解HPLC在中藥分析方面的應用。
(2)熟悉梯度洗脫的設計和操作。
2、實驗原理
中藥(植物藥)中，含有多種有機和無機化合物，如生物堿、黃酮、皂苷、多聚糖等。每一味中藥都有它獨特的一種或幾種主要有效成分。弄清中藥的有效成分是中藥分子藥理學的關鍵，川芎中的有效成分之一是藁木內酯。中藥的傳統炮制法是水煎，因此很多水溶性(極性)物質被提取出來，由于這些水溶性有機分子的協同作用，也會有很多脂溶性(非極性)物質被提取出來。本實驗采用反相HPLC體系來分離川芎提取液。在反相HPLC中，極性物質先流出，非極性物質后流出。要能在盡可能短的時間內達到較好的分離，選擇適當極性的流動相是關鍵。對于較簡單的樣品可以采用均一的混合溶劑作為洗脫液(稱等強度洗脫)，但對于復雜的混合物，如中藥提取物，必須采用梯度洗脫的方法，既流動相的極性隨時間在變化，洗脫能力不斷增加，使各組分既能得到彼此的分離，又能使色譜峰分布均勻。
川芎中有機物在210～300nm范圍內有較強的吸收。因此可采用紫外檢測器進行檢測。采用外標法(一點工作曲線法)對川芎的主要成分藁本內酯進行定量。
3、儀器與試劑
儀器：高效液相色譜儀，紫外檢測器，梯度淋洗裝置，溶劑脫氣裝置。
試劑：甲醇(色譜純)，水(重蒸去離子水)，川芎浸膏，藁本內酯標準樣品。
4、實驗內容與步驟
(1)參照儀器使用說明，使儀器處于工作狀態。
(2)設置色譜參數：色譜柱為C18柱；流動相A為甲醇，B為水；流速為1.0mL／min，柱溫30℃；檢測波長270nm。
(3)配置藁本內酯標準樣品溶液：準確稱量藁本內酯標樣，以甲醇為溶劑配置，濃度約為1000mg／L。
配置被測樣品：稱取川芎浸膏250mg，用甲醇溶解定容至50mL。
(4)先以50 %的甲醇／水溶劑等強度洗脫，用六通閥注入被測樣品，觀察分離情況。
(5)再以80％的甲醇／水溶劑等強度洗脫，重復(4)的操作。
(6)設置梯度程序：開始為90％的B，60min內線性地改變為100％A，用六通閥注入被測樣品，觀察分離情況。
(7)檢測波長分別設為260nm，280nm，注入被測樣品。
(8)選擇適宜的色譜條件(流動相，檢測波長)注入藁本內酯標樣，記錄保留時間和峰面積(用以定性和計算校正因子)，重復3次，取平均值(面積誤差小于3％)。
(9)注入被測川芎提取液樣品，重復3次，取平均值(面積誤差在3％之內)。
(10)按關機程序關機。
5、注意事項
(1)如果實驗直接用市售川芎飲片作樣品時，可以稱取適量飲片，用水提取1h(保持微沸)，水提物用微孔膜過濾后直接進樣，或用氯仿等溶劑萃取后進樣。
(2)中藥提取物中成分復雜，所含糖類、蛋白類等物質有可能使色譜柱性能下降，必要時將川芎浸膏用溫水溶解后，用氯仿或乙酸乙酯萃取，有機相作為樣品即可。
6、數據處理
(1)整理出不同條件下的色譜峰的保留時間、峰面積，計算藁本內酯的分離度。
(2)用外標法計算川芎浸膏中的藁本內酯的含量。
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